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                【安捷倫】單抗藥物電荷異老重慶時時彩360走勢圖質性分析的新時代現已來臨!

                老重庆时时彩平台 2019/04/26 10:10:49 點擊 148 次

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                6 月:國內首款 PD-1 單克隆抗體藥物獲批,中國跨入腫瘤免疫時代

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                腫瘤免疫360老重慶時時彩開獎號碼治療的火爆讓單克隆抗體藥物(下文簡⊙稱單抗)的研█究越來越受到關註,今天我們就來聊聊單抗的一大特性——電荷異質性

                抗體是指能與相應抗原特異結合的具有免疫活性的球蛋白,而單抗是由單一 B 細@胞克隆產生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體。同其它蛋360彩票老重慶時時彩白一樣,單抗常常存在廣¤泛的翻譯後修飾和降解,如糖基化、碳端〒賴氨酸丟失、脫酰胺化、二硫鍵錯老重慶時時彩歷史開獎號碼查詢配、糖化和氧化等。幾乎這些所有的翻譯後修飾都會直接或間接的引起單抗表面電荷的變化,這就是單抗的電荷異質性。電荷異質性影響單抗的體外及體內的活性、安全性、可行性和質量,在☆新藥研發和生物類似藥的開發中都非常重老重慶時時彩舊版要。

                電荷異質性的檢測通常采用基於電荷分離的技術手段,如離子交換色譜、毛細管等電▅聚焦◤(CIEF),以及成像毛細管等》電聚焦(iCIEF)等。與主峰  (Main peak)  相比,這些變異體峰通常被稱為酸性峰  (Acidic variants)  和堿性峰  (Basic variants) 。大部分的人源 IgGs 具有堿性的等電點,因此,陽離子交換色譜通常被用於分離。在主峰前面的峰通常稱為360彩票老重慶時時彩酸性峰,因為其帶有的老重慶時時彩冷熱正電荷較少,洗脫較快;在主峰後面的峰稱為堿性峰。酸堿峰的鑒定采用離線收集鑒定或多維液相-質╲譜聯機在線鑒定。

                圖 1. 陽離子交換色譜分離酸堿峰示例圖

                毛細管等電聚焦(CIEF)是電荷異質性表征的主要手段,但采用 CIEF 分離時收集餾①分用於鑒定非常困難,所以 CIEF 通常用於監控電荷異質性而不能用於表征。質譜老重慶時時彩在哪裏買檢測雖然廣泛應用於單抗的表征,但是將 CIEF 和 MS 聯機一直是非常大的挑戰。質譜在線檢測的缺失也限制了 CIEF 在蛋白電荷異質性的表征上的應用。將 CIEF 分離的高分╱辨特性和質譜的表征能力結合起來〇是電荷異質性表征迫切需要的技360老重慶時時彩走勢圖術。


                Agilent 7100 CE-QTOF 聯機的特點

                無與倫比的毛細管分離的分辨率:甘油改性劑降低非 CIEF 電泳老重慶時時彩開獎號碼遷移和區帶展寬

                兩性電解質:兼顧電泳分辨率和質譜靈敏度

                質譜友好的陽極液和陰極液

                優化的鞘流⌒ 液組成:有效→的聚焦、遷移和電老重慶時時彩走勢圖360噴霧離子化

                納流級別的鞘流液流速:基於電滲流技術的納流鞘流液最大限度提高檢測靈敏度

                優化的 CIEF 運行參數:進樣量、電場強度、壓力

                靈敏度高、抗汙染的質譜:Agilent 6200 系列 TOF,6500 系列 Q-TOF

                圖 2.  Agilent 7100 CE-QTOF 聯機圖


                CIEF-MS 的方法可行性及卓越表現

                采用等電點標記∏物(pI markers)進行驗證,等電點和遷移時間之間具有良好的線性相關性ξ (R^2=0.99)。此外,CIEF-MS 方法采集的四種單抗↙的電荷變異體分離的輪廓圖老重慶時時彩開獎查詢也通過成像毛細管等電聚焦紫外方法比對驗證一致。pI markers 的絕對遷移時間的相對標老重慶時時彩在哪裏準偏差小於 5%(n=4)。貝伐單抗三次進樣的相對遷移時間 RSD 小於 1%,絕對遷移時間小於 2.3%,峰面積的 RSD 小於 7%。並且,單抗的電荷變異體可通過質譜直接測得其分子量。

                CIEF-MS 采集的電荷變異體輪廓分布和 iCIEF-UV 檢測具有高度的一致性。iCIEF-UV 通過全柱成像檢測去ζ 除了等電聚焦後分析物遷移到檢」測器端的步驟,CIEF-MS 和 iCIEF-UV 檢測結果的老重慶時時彩歷史開獎號碼查詢高度一致性證明了在線 CIEF-MS 分析單抗電荷變異體史無前例的高分辨率。除了高分辨率之外,該方法具有非常好的重現性。


                CIEF-MS 電荷異質性分析的應用實例大集結

                貝伐珠單抗的分析

                CIEF-MS 和 iCIEF-UV 分析得到的酸堿峰比例接近,分別為酸性ξ 峰: 主峰: 堿性峰= 23% : 72% : 5% 和 27% : 68% : 5%。除了 CE 的高分離度之外,質譜數據優異的原始譜360彩票老重慶時時彩圖是實驗分析制勝老重慶時時彩開獎號碼查詢的關鍵,尤其是在鑒定跟主峰質量差別很小的變異體時,如在分析一個脫酰胺  (+1Da)  質量差時,一款性能優異的質譜是 CIEF-MS 分析的必備之選。

                貝伐珠◣單抗的主峰分子量為 149 202 Da,堿性峰 B1 和主峰之間的質量差為 +128 Da,和碳端賴氨酸ω (+128 Da, +1K)  異質性匹配老重慶時時彩歷史開獎;堿性峰 B2 (?=-17Da)  和氮端焦谷氨酸環化修飾 (-17Da)  匹配;酸性峰 A1 (?= 1Da)  和脫酰胺修飾匹配。酸性峰 A1 和主峰只有 1 Da 的質量差別,雖然我們會擔心質譜準確度因素帶來的不確定①性,但酸性峰的位置和正好 1 Da 的質量差讓我們有理由相信酸性峰 A1 是脫☆酰胺的修飾峰。A2 峰的信號非常弱老重慶時時彩開獎查詢老重慶時時彩在哪裏買,可能是高糖基化修飾的峰。

                圖 3. 貝伐珠單抗 CIEF-MS 分析結360老重慶時時彩開獎記錄果圖

                曲妥珠※單抗的分析

                曲妥珠單抗和貝伐珠單抗的電荷異質性老重慶時時彩走勢圖360分布的差異較大。iCIEF-UV 測得的低含量堿峰老重慶時時彩冷熱在CIEF-MS上未檢出,同時其對酸峰的分◆離效果也優於 CIEF-MS 分離。質譜檢測結果清晰的老重慶時時彩360走勢圖展示了酸性峰中四種主要的糖型變異體。曲妥珠單抗的主峰分子量為148 224 Da,酸性峰 A1 (?m = +1Da) 和酸性峰 A2 (?m = +2Da) 和脫酰胺修飾匹配,並且和 2D CZE-MS 的結果一卐致。

                圖 4. 曲妥珠單抗 CIEF-MS 分析結果圖

                英夫利老重慶時時彩走勢圖360昔單抗的分析

                英夫利昔單抗的三個電荷變異體峰在 CIEF-MS 上有良好的分離。解卷積結果顯示兩個老重慶時時彩360開獎號碼堿峰為碳端賴氨酸變異體,堿性峰 B1 (?m = +258 Da) 和兩個賴氨酸匹配;堿性峰 B2 (?m = +129 Da) 和一個賴氨酸匹配;酸性峰 A (?m = +5 Da) 小的〖質量偏差顯示其可能為脫酰胺的修飾。

                圖 5. 英夫利昔單抗 CIEF-MS 分析結果圖

                西妥昔單老重慶時時彩歷史抗的分析

                西妥昔單抗是人鼠嵌合的 IgG-1 單抗,具有高度的微觀不均一360老重慶時時彩開獎號碼性,該特性主要源於高度復雜的糖老重慶時時彩360開獎基化修飾。西妥昔單抗重鏈的 Fab 和 Fc 上各有一個糖基化位點,同時有碳端賴』氨酸的不完全剪切,這些高度的異質性會造成分離上的困難。采用 CIEF-MS 實現了八個電荷變異體的良∑ 好分離,不僅和 iCIEF-UV 的結果一致,同時也和文▽獻報道一致。但是由於西妥昔單抗復雜的糖基化修飾,通過質譜獲得的分子量信息不足以反應修飾的情老重慶時時彩在哪裏況。

                圖 6. 西妥昔單抗 CIEF-MS 分析結果圖

                西妥昔單抗亞基水平☆的分析

                針對西妥昔單『抗這類具有復雜異質性的抗體,通過 IdeS 酶切和 DTT 還原降低其復雜△程度,更利老重慶時時彩360安全購於質譜檢測。通過高分辨質譜檢測,IdeS 酶切後的八個變異體老重慶時時彩開獎查詢峰及 IdeS 酶切同時 DTT 還原後得到的 11 個變異體都得以檢測。研究發現,西妥昔單抗的電荷異質性主要源於 Fc 區末端賴氨酸的異質性、Fd’ 區 N-羥乙酰神經氨酸和可能存♀在的脫酰胺修飾。輕鏈上未發〖現有電荷異質性。

                圖 7. 亞基水平 CIEF-MS 分︽析流程圖

                安捷倫 CE-QTOF 解決方老重慶時時彩在哪裏買案不僅兼顧了毛細管電泳的高效分離,離子源接口的高靈敏度和高分離度,也實現了質譜的高老重慶時時彩歷史開獎號碼靈敏高分辨檢測。在完整蛋白分析的層次上增加亞基水平的解決方案,即使是具有高度復雜異質性的抗體分析也♀能輕松應對。

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                參考文獻:

                1. 安捷倫◣應用文獻 5994-0672EN

                2. Jun Dai,*,? Jared Lamp,? QiangweiXia,? and Yingru Zhang?, Capillary Isoelectric Focusing-Mass SpectrometryMethod for the Separation and Online characterization of Intact Monoclonal AntibodyCharge Variants. Anal Chem. 2018 Feb 6;90(3):2246-2254

                3. Jun Dai, and Yingru Zhang, AMiddle-Up Approach with Online Capillary Isoelectric Focusing-Mass Spectrometryfor In-depth Characterization of Cetuximab Charge Heterogeneity. Anal. Chem.,2018, 90 (24), pp 14527–14534


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